相差顯微鏡的介紹及說明

相差顯微鏡介紹：

相差顯微鏡又稱相襯顯微鏡是荷蘭科學家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標本的顯微鏡。活細胞和未染色的生物標本，因細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化（振幅差），這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。

理論基礎

相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位指在某一時間上，光的波動所達到的位置。一般由于被檢物體（如不染色的細胞）所能產(chǎn)生的相差太小，肉眼很難分辨，只有在變相差為振幅差（明暗差）之后才能被區(qū)分。相差決定于光波所通過介質的折射率之差及其厚度，等于折射率與厚度的乘積之差（即光程之差）。而相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進行鏡檢的。

細胞生物學的研究儀器中 相差顯微鏡，透射電子顯微鏡和掃描隧道電子顯微鏡的設計或發(fā)明獲得了諾貝爾獎。

差別

相差顯微鏡有四個特殊結構：相差物鏡、具有環(huán)狀光闌的轉盤聚光器、合軸調中望遠鏡和綠色的濾光片。綠色濾光片作用是：縮小照明光線波長范圍，減少由于照明光線的波長不同引起的相位變化。

用途

觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。

基本原理

利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┑牟顒e，經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現(xiàn)觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。

把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡4個特殊之處：

1.環(huán)形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。

2.相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。

（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗。

3.合軸調節(jié)望遠鏡：用于調節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面*吻合。

修理維護

相差顯微鏡使用中的幾個問題：

（1）相位倒轉 當n’<n或n’>n時得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉。當相位差δ=0時是無法識別的，隨著δ的增大反差變大，當δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉。用90%高吸光值（高反差）物鏡時，這個轉變值約為0.55λ，用70%標準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應該用于分辨較小的光程差。

（2）暈輪和漸暗效應 在相差顯微鏡成象過程中，某一結構由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點，它妨礙了精細結構的觀察，當環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現(xiàn)象是漸暗效應，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時，該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。

（3）樣品厚度的影響 當進行相差觀察時，樣品的厚度應該為5μm或者更薄，當采用較厚的樣品時，樣品的上層是很清楚的，深層則會模糊不清并且會產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。

（4）蓋玻片和載玻片的影響樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質量也有較高的要求，當有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時會產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。